Вакцина против болезни гамборо. Болезнь Гамборо: мониторинг качества вакцинации методом ИФА

Ветеринария

Вакцинация и вакцины против болезни Гамборо/Vaccination and gumboro disease vaccines

Я. Гарден, руководитель биологических инновационных стратегий, «Сева Санте Анималь

Вирус болезни Гамборо широко распространен, а так же устойчив во внешней среде. По этой причине точность вакцинации бройлеров должна достигать 100% и иммунитет, вызванный вакциной, должен постоянно оставаться на высоком уровне. Более того, вакцинация должна способствовать снижению концентрации вируса болезни Гамборо в окружающей среде для последующих циклов производства.

Стратегия вакцинации против болезни Гамборо строится на защите цыплят в течение первых недель жизни пассивным иммунитетом, переданным родителями потомству, а затем активным иммунитетом, обеспеченным вакцинацией. При этом формирование активного иммунитета должно происходить на фоне все еще эффективного пассивного иммунитета. Успешная программа вакцинации зависит от правильного выбора вакцины и использования эффективной процедуры вакцинации. Идеальная вакцина против болезни Гамборо должна удовлетворять следующим требованиям:

• быть безопасной, то есть не вызывать ни иммунодепрессии, ни любых других побочных эффектов;

• эффективно защищать цыплят от негативных последствий заражения специфическим вирусом ИББ;

• создавать у бройлеров или молодняка устойчивость к заражению полевым вирусом и исключать появление нового патогенного варианта;

• активизировать иммунную систему в присутствии пассивного иммунитета;

• компенсировать (ограниченно) пропуски при вакцинации посредством горизонтального распространения или других механизмов.

Вакцины против болезни Гамборо

В настоящее время существуют вакцины следующих категорий:

• инактивированные (или убитые) ИББ вакцины, содержащие инактивированные целые вирусы ИББ или их части, представленные в виде эмульсии с минеральным маслом, которое выполняет роль адъюванта. В большинстве случаев эмульсии принадлежат к типу «вода в масле»;

• классические живые аттенуированные ИББ вакцины, произведенные из живых аттенуированных штаммов вируса ИББ и представленные в виде замороженных сухих (лиофилизированных) продуктов. Штаммы вируса ИББ, используемые в этих вакцинах, естественно или искусственно аттенуированы (ослаблены), так что мы можем дифференцировать различные типы в зависимости от их степени аттенуации: «мягкие» (сильно аттенуированые), «средние» (достаточно аттенуированные), «средние плюс» (средне аттенуированные) и «горячие» (слабо аттенуированные);

• иммунокомплексные ИББ вакцины, произведенные из живых аттенуированных штаммов ВИББ «среднего плюс» типа, смешанных в определенной пропорции со специфической антивирусной сывороткой. Конечный продукт представлен в сухом замороженном виде;

• рекомбинантные векторные ИББ вакцины, полученные в результате генной инженерии вируса (вектора), геном которого содержит ген специфического вируса ИББ (донора), кодирующий VP2 белок капсида вируса ИББ (донора). В настоящее время в качестве вектора используется герпесвирус индеек (HVT), который ассоциирован с фибробластами куриных эмбрионов. Данная вакцина — суспензия инфицированных клеток, которая хранится замороженной в жидком азоте.

Многочисленные лабораторные и производственные эксперименты существенно расширили наши знания о данных категориях вакцин. Сегодня мы знаем намного больше о том, что можно ожидать от них, помимо простого критерия защиты. Это безопасность в полевых условиях и эффективность в различных условиях заражения, защита от клинической или субклинической формы болезни, защита от заражения (вирусная защита), а также влияние на краткосрочную и долгосрочную эволюцию болезни и динамику иммунного ответа, который должен соответствовать характеристикам заражающего фактора.

Рассмотрим самые современные вакцины против болезни Гамборо.

Иммунокомплексные вакцины против ИББ

Живой аттенуированный «средний плюс» вирус смешан в определенной пропорции с сывороткой, полученной от СПФ цыплят, гипериммунизированных против ИББ.

В этом случае вакцинный вирус покрыт и, следовательно, защищен от распознавания иммунной системой цыплят специфическими иммуноглобулинами (вирусзащищающие иммуноглобулины, VPI).

После введения VPI распадаются, одинаково как и МАТ, и вакцинный вирус освобождается. «Работа» вакцины, которая выражается в репликации вакцинного вируса в бурсе, начинается, когда уровень МАТ достигает значения, позволяющего вакцине «работать», и перед тем, как стадо становится восприимчивым к инфекции. Основные преимущества этой технологии заключаются в следующем:

• Качество и сила защиты, свойственные репликации живого аттенуированного «среднего плюс» вируса в бурсе, сохраняются: полная защита против клинических признаков; высокая степень устойчивости против заражения, независимо от патогенности штамма вируса ИББ; предотвращение распространения вируса.

• Вакцина адаптируется к иммунному статусу каждого цыпленка индивидуально и всегда реплицируется в оптимальное время.

• Вакцина может быть применена при наличии пассивного иммунитета, поэтому интерференция с родительским иммунитетом отсутствует.

• Вакцина может вводиться в инкубатории, поэтому надежность и точность вакцинации максимальны. Каждый цыпленок получает дозу вакцины.

• После репликации вакцинный вирус выделяется и распространяется в стаде, поэтому некоторые пропуски вакцинации могут быть восполнены.

Безопасность иммунокомплексных вакцин подобна безопасности «средних плюс» вакцин при более точном качестве вакцинации, поэтому каждый цыпленок получает одинаковую дозу вакцины. Многолетний опыт использования в производственных условиях показывает надежность и безопасность этой категории вакцин.

Иммунокомплексные ИББ вакцины весьма привлекательны в сравнении с другими существующими категориями ИББ вакцин, если рассматривать различные аспекты эффективности ИББ вакцин и отдельно их способность не только защищать от клинических признаков заболевания, но обеспечивать полный контроль болезни Гамборо.

Динамика иммунного ответа

В настоящее время для производства иммунокомплексных вакцин используют только живые аттенуированные штаммы вируса ИББ «среднего плюс» типа. После введения вакцины методом in ovo или подкожно в суточном возрасте вакцинные вирусы, покрытые специфическими иммуноглобулинами, защищены от нейтрализации материнскими антителами.

Однако специфические иммуноглобулины (VPI) распадаются в течение первых недель жизни, и вакцинный вирус, освобождаясь от VPI, в организме цыпленка нейтрализуется МАТ. Иммунизация происходит, когда уровень МАТ снижается до уровня, позволяющего вакцинному вирусу реплицироваться в бурсе цыпленка.

Многолетний производственный опыт показывает, что иммунизация каждого цыпленка в стаде происходит в пределах короткого периода времени (ИФА Biochek), между 3 и 4­й неделями жизни (см. схему 1).

Данный временной интервал применим к большинству предприятий, поскольку даже цыпленок, имеющий низкий уровень МАТ, будет иммунизирован до момента заражения вирусом ИББ.

Живые рекомбинантные rHVT­VP2 векторные вакцины против ИББ

Векторному вирусу живых рекомбинантных rHVT­VP2 (рекомбинантный вирус герпеса индеек) вакцин необходимо многократно реплицироваться в организме птицы для иммунного ответа на VP2 белок.

В сравнении с живыми аттенуированными ИББ вакцинами «среднего плюс» типа иммунитет при использовании рекомбинантной вакцины не является результатом репликации в организме целого вируса, запускающей все механизмы иммунной системы («полный» иммунитет»). Иммунитет в этом случае вырабатывается вследствие иммунного ответа на VP2 антиген рекомбинантного HVT вируса.

Вирус HVT широко используется в качестве вакцинного штамма для защиты от болезни Марека (MD) — как один, так и в комбинации с SB­1 или Rispens серотипами. Полный механизм защиты против болезни Марека еще не установлен, но понятно, что иммунитет формируется сразу после фазы виремии, в течение примерно 10 дней после заражения. Иммунный ответ к вирусу болезни Гамборо вследствие реакции организма на VP2 белок является более длительным процессом. Формирование иммунного ответа против ИББ требует гораздо большего времени, в отличие от иммунитета против болезни Марека. Необходимо упомянуть один важный момент, если говорить о рекомбинантных векторных вакцинах в целом и отдельно о rHVT­VP2: особенности и потенциал вакцины сильно зависят от «конструкции», которая включает:

• штамм, выбранный в качестве вектора;

• степень аттенуации этого штамма (т.е. количество пассажей штамма, которое влияет на его способность к репликации);

• последовательность в геноме, выбранная для вставки (какие протеины кодируются какой последовательностью);

• происхождение VP2 вставки (какой штамм ВИББ используется: классический, классический вирулентный, классический высоковирулентный, вариантный);

• местоположение выбранной вставки;

• промоутер, использованный для стимуляции экспрессии вставленного гена;

• способ осуществления рекомбинации и т.д.

Это лишь немногие факторы, объясняющие значительную разницу между вакцинами, которые обладают универсальным именем
«rHVT­VP2» и имеют различия только в коммерческих названиях.

Поэтому важно подчеркнуть, что информация по поводу rHVT­VP2 вакцин и заключения, касающиеся их особенностей и рекомендаций по использованию, приведенные в данной статье, относятся к представленным на рынке в настоящее время rHVT­VP2 вакцинам.

Рекомбинантные вакцины привлекательны, так как их безопасность идентична безопасности HVT вакцин.

Уровень и динамика иммунного ответа

Векторная вакцина против болезни Гамборо формирует иммунитет в течение нескольких недель после введения вакцины, в противоположность живым аттенуированным ИББ вакцинам, создающим полную защиту в течение нескольких суток после репликации целого вируса (см. эксперимент В).

Так как МАТ у несушки, кур родительского стада и птиц выгульного содержания распадаются более длительное время (из­за медленной скорости роста), применение рекомбинантных вакцин rHVT­VP2 на данной группе птицы более оправдано. Сроки МАТ у бройлеров более короткие, и поэтому МАТ распадаются раньше, чем формируется иммунитет при использовании векторной вакцины. По этой причине, когда схожие рекомбинантные rHVT векторные вакцины используются для профилактики болезни Ньюкасла (rHVT­F) у бройлеров, медленное формирование иммунитета компенсируется применением живых аттенуированных НБ вакцин спрей­методом в инкубатории в суточном возрасте для стимуляции иммунитета слизистых оболочек. Если наблюдается высокая концентрация вирусов болезни Ньюкасла, также рекомендуется дополнительное применение живой вакцины (например La Sota).

Применение живых вакцин против болезни Гамборо в суточном возрасте невозможно из­за интерференции с МАТ. В производственных условиях в случае высокой концентрации вируса ИББ рекомендовано применение живых аттенуированных вакцин против Гамборо «среднего плюс» типа в двухнедельном возрасте.

Антигенный ответ на VP2, вызванный rHVT­VP2 вакциной, может быть обнаружен путем различных серологических исследований, включая реакцию вируснейтрализации и ИФА.

Другой важной особенностью иммунитета, вызванного рекомбинантной вакциной против болезни Гамборо, является ограниченная защита цыплят от репликации вирулентного вируса в клетках бурсы. В результате концентрация вирусов ИББ в пределах птицефабрики поддерживается или увеличивается.

В заключение необходимо отметить, что защита рекомбинантных вакцин более эффективна против полевых вирусов, имеющих схожий VP2. Именно поэтому часто можно увидеть стада, вакцинированные rHVT­VP2, с признаками инфекции (наличие макро­ и микроскопических повреждений и обнаружение полевого вируса в бурсе методом ПЦР). Так как защита является неполной, отличные от вакцинного штамма вирусы ИББ способны к репликации, что способствует появлению новых вариантных штаммов ВИББ. Новые вариантные штаммы способны преодолевать защиту МАТ гораздо раньше, и заболевание выходит из­под контроля.

Последнее, что необходимо упомянуть о рекомбинантных вакцинах rHVT­VP2, это зависимость иммунитета от дозы применяемой вакцины. Меньшая доза вакцины приводит к задержке формирования иммунитета или снижению его уровня.

Резюме. Вирус болезни Гамборо (инфекционная бурсальная болезнь, ИББ) является уникальным с точки зрения патогенеза, и поэтому вакцины против данного заболевания должны соответствовать специальным требованиям. Поиск идеальной вакцины против болезни Гамборо ведется постоянно. Помимо простого критерия защиты, необходимы безопасность в полевых условиях и эффективность в различных условиях заражения, защита от клинической или субклинической формы болезни, защита от заражения (вирусная защита), а также влияние на краткосрочную и долгосрочную эволюцию болезни и динамику иммунного ответа, который должен соответствовать характеристикам заражающего фактора.

Summary. The Gumboro disease virus (infectious bursal disease, IBD) is unique in terms of pathogenesis, and therefore vaccines against this disease must meet special requirements. The search for the perfect vaccine against Gumboro disease is ongoing. In addition to a simple protection criterion, field safety and effectiveness in various conditions of infection, protection against the clinical or subclinical form of the disease, protection against infection (viral protection), as well as the effect on the short­term and long­term evolution of the disease and the dynamics of the immune response, which must correspond characteristics of the infecting factor.

Инфекционный бурсит птиц (болезнь Гамборо)

Источником и распространителем инфекции являются зараженные птицы. Передача вируса осуществляется больными и переболевшими птицами через зараженные корма, воду, подстилку, предметы ухода, инфицированную скорлупу яиц и обслуживающий персонал. Механическими переносчиками вируса ИББ являются грызуны, мухи, клещи, жуки-чернотелки, черви [4].

Первое звено – РНК-содержащий вирус семейства Birnaviridae, возбудитель инфекционного бурсита птиц (синонимы: болезнь Гамборо – БГ, инфекционная бурсальная болезнь – ИББ) [8]. К данному заболеванию наиболее восприимчивы цыплята от 2- до 20-недельного возраста и яичных, и мясных кроссов [3].

Второе звено – ворота инфекции. Они представляют собой место проникновения вируса через слизистые оболочки пищеварительного (основной путь) и респираторного трактов [1].

Третье звено – патогенное воздействие возбудителя инфекционного бурсита птиц при алиментарном пути заражения.
Вирус проникает в организм птиц в основном через пищеварительный тракт, представляющий собой систему трубок, переходящих одна в другую, и обнаруживается в клетках кишечника и лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта (Могут отмечаться геморрагии и атрофия цекальных миндалин, кровоизлияния на сосочках и границе между железистым и мышечным желудками, в основном располагающиеся по направлению хода корма и не сливающиеся между собой, из-за чего поверхность перехода между желудками поражается не вся.) [11]. Репликация вируса в энтероцитах ворсинок и криптах приводит к нарушению секреторной функции кишечника и, как следствие, – к внезапному развитию диареи, провоцирующей птиц к расклевыванию заднепроходного отверстия, и к обезвоживанию организма, проявляющемуся сухостью кожи, потемнением и депигментированностью мышц [7].

Справка.
Слизистая оболочка кишечника образует продольные и поперечные складки – ворсинки, между основаниями которых открываются трубчатые общекишечные железы, или крипты.
Собственная пластинка слизистой оболочки располагается между криптами и заходит внутрь ворсинок, образуя их строму. В строме под эпителием находятся лимфатические синусы и сеть кровеносных капилляров.

Среди клеток стромы располагаются соединительнотканные клетки — ретикулярные, фибробласты, гистиоциты, эозинофилы, гладкомышечные клетки, лимфоциты (как сформированные в группы – пейеровые бляшки, илиоцекальные или слепокишечные миндалины, так и представленные в виде разбросанных одиночных фолликулов). [5].

Из кишечника с помощью лимфоидных клеток и макрофагов вирус (благодаря взаимодействию с клеткой) проникает в кровеносную систему и, минуя купферовские клетки печени, начинает персистировать по организму, пытаясь достичь основного органа-мишени – бурсы Фабрициуса, содержащей лимфоидные фолликулы, в которых происходит рост и созревание предшественников В-лимфоцитов [3]. Первоначальным препятствием (если в качестве примера мы возьмем недавно вылупившихся цыплят) на пути вируса будут являться материнские антитела, но только до тех пор, пока их уровень не снизится ниже порога защиты [9].

Данный показатель зависит от количества материнских антител, т. е. цыплята, имеющие низкий уровень антител, будут подвержены риску заражения раньше, а цыплята с более высоким уровнем – позже. Хотя вирус ИББ при инфицировании цыплят не вызывает у них никаких видимых клинических симптомов или падежа, он может стать причиной очень сильной иммуносупрессии, проявляющейся подавлением роста и развития и возникновением вспышек различных заболеваний [13].

Следует отметить, что уровень антител не уменьшается в течение полных четырех дней жизни цыпленка (То есть уровень антител в течение данного отрезка времени будет постоянным, несмотря на их непрерывный распад.) за счет пополнения антителами, содержащимися в желточном мешке [9]. Первоначальное снижение титра антител на 1 log2 (То есть вдвое (период полураспада).) происходит у цыплят в возрасте четырех дней, а дальнейшее снижение будет зависеть от уровня метаболизма и интенсивности роста птицы (Например, для промышленных несушек период полураспада составляет 5 дней, для яичных кур родительского стада – 5,0–5,5 дня, для бройлеров – 3,0–3,5 дня, для родителей мясных кур – 4,5 дня. Стоит добавить, что приведенные показатели периода полураспада условны и для каждого конкретного хозяйства должны устанавливаться лабораторно.) [6].

Справка.
Одной из особенностей капилляров печени является наличие в их стенках звездчатых (купферовских) клеток неправильной формы. При появлении в крови раздражающего агента (чужеродных белков, токсинов, инородных тел и др.) эти клетки выходят из эндотелиального пласта и преобразуются в свободные макрофаги, осуществляя фагоцитарную функцию [5].

Если вовремя не создать защитный барьер при помощи проведения качественной вакцинации против ИББ, то вирус достигнет фабрициевой сумки и внедрится в клетки – предшественники В-лимфоцитов (особенно В-клетки, содержащие Ig M), где и начнет свою репликацию, приводя к тотальному разрушению этих клеток [8].

При этом через 2–3 дня после поражения данного лимфоидного органа отмечается его увеличение в объеме более чем в 2–3 раза. На серозной оболочке фабрициевой сумки может наблюдаться скопление желатиноподобного студенистого транссудата (перибурсальный отек) (рис. 1), который полностью пропадает при реверсии (возвращении) клоакальной сумки к нормальному размеру [12]. Слизистая оболочка гиперемированная (рис. 2), иногда пронизана точечными и разлитыми кровоизлияниями (рис. 3), в некоторых случаях в просвете между складками откладываются сгустки фибрина (фибринозный бурсит) (рис. 4), а в тяжелых случаях – кровянистая жидкость или сыроподобные слепки [3].

При хроническом протекании болезни изменения могут отсутствовать или быть менее выраженными и проявляться лишь легкой гиперемией слизистой оболочки. На 10–20-е сутки после заражения наблюдаются прогрессирующая атрофия фабрициевой сумки и истончение складок ее слизистой, нередко с наличием петехиальных кровоизлияний [11].

Вследствие разрушения большого количества лимфоцитов развивается иммунодефицитное состояние (иммуносупрессия), на фоне которой повышается восприимчивость к вирозам (НБ – ньюкаслская болезнь, ИБК – инфекционный бронхит кур, ИЛТ – инфекционный ларинготрахет, БМ – болезнь Марека, ВАЦ – вирусная анемия цыплят, МПВИ – метапневмовирусная инфекция, адено- и реовирусной инфекции и др.), бактериозам (колибактериозу, сальмонеллезу [12], некротическому энтериту, гангренозному дерматиту и др.), микоплазмозам, снижается эффективность иммунизации пораженной птицы против НБ, ИБК, БМ и др. [2]

Вакцинные штаммы против болезни Гамборо тоже обладают иммунодепрессивным действием и вызывают у привитых цыплят вторичный иммунодефицит, поэтому при введении живых вакцин против БГ (даже слабовирулентных штаммов) неизбежно возникают поражения лимфоидной ткани бурсы Фабрициуса, тимуса, селезенки, гардеровой железы и слепокишечных миндалин [8, 12].

Рис. 1. Перибурсальный отек фабрициевой сумки (скопление желтоватого студенистого транссудата)

Рис. 2. Серозный бурсит

Рис. 3. Точечные кровоизлияния на слизистой оболочке фабрициевой сумки

Рис. 4. Фибринозный бурсит (наличие фибрина на складках бурсы)

После инфицирования фабрициевой сумки наступает второй этап – этап обширной вирусемии.
Распространяясь по всему организму, вирус может находиться как в свободно циркулирующей форме, так и в форме иммунных комплексов «антиген – антитело». Накапливаясь в стенках кровеносных сосудов, они активируют комплемент (Система белков крови, которая активируется при попадании в организм чужеродного материала) , что и приводит к их разрушению (Нарушаются факторы свертывания крови) и возникновению кровоизлияний в грудных, бедренных мышцах (рис. 5), а также в мышцах крыла (Кровоизлияния иногда сливаются между собой в более крупные – геморрагии.) , фабрициевой сумке и иногда – на печени (Печень может быть увеличенной, на ее поверхности видны следы от ребер; по краям долек – небольшие инфаркты. ) [1, 11].

Рис. 5. Полосчатые и точечные кровоизлияния на мышцах

Тимус либо в пределах нормы, либо уменьшен в объеме и гиперемирован. Селезенка, увеличена, мягкой консистенции, темно-красного цвета (при воздействии высоковирулентных вирусных штаммов отмечается атрофия тимуса, селезенки и красного костного мозга) [3].

Развитие нефрозонефрита также связано с воздействием (оседанием) циркулирующих в крови комплексов «антиген – антитело», вызывающих некроз и десквамацию эпителия капилляров извитых канальцев и сосудистых клубочков (так называемые тигровые почки) [11].

При осложнении данного заболевания отмечается возникновение серозно-фибринозного перикардита, перигепатита, аэросаккулита, плевроперитонита и т. д.

Четвертое звено – выделение вируса в окружающую среду, осуществляемое в основном с пометом. [8]

Пятое звено – постановка диагноза на основании результатов клинико-эпизоотологических, патолого-анатомических, вирусологических, гистологических и серологических исследований сыворотки крови на наличие антител к возбудителю данного заболевания. Кроме того, на вирусологическое и серологическое исследование направляется клоакальная сумка, а на гистологическое и цитологическое – этот же орган и почки. [3, 8]

Шестое звено – лечение. Методов лечения на сегодняшний день не разработано.

Седьмое звено – профилактика. Комплекс профилактических мероприятий основывается на соблюдении установленных ветеринарно-санитарных требований и на правильном применении живых, инактивированных и векторных вакцин.

По преодолению различных уровней материнских антител вакцины против ИББ, используемые методом выпойки, подразделяются:

1. на мягкие вакцины, способные пробивать титр материнских антител до 125 в ИФА;
2. интермедиальные вакцины, способные пробивать титр материнских антител до 250 в ИФА;
3. интермедиальные «+» вакцины, способные пробивать титр материнских антител до 500 в ИФА;
4. интермедиальные «++» вакцины, способные пробивать титр материнских антител в пределах 500–1000 в ИФА;
5. горячие вакцины, способные пробивать титр материнских антител в пределах 1000–1500 в ИФА. [10]

Самые лучшие результаты в птицеводческих хозяйствах отмечаются при применении вакцин, имеющих однородную генетическую структуру и молекулярную группу с полевым вирусом (для определения генетической структуры и молекулярной группы необходимо проводить ПЦР). [10]

Штаммы вирус-вакцин, используемые для вакцинации птицепоголовья против инфекционной бурсальной болезни (Для иммунизации цыплят в птицеводческих хозяйствах различных направлений выращивания)

Молекулярные методы контроля болезни Гамборо (IBD)

Доктор Marcos Bentué «Laboratorios Hipra» Испания

Европейская птицеводческая индустрия уже в течение долгого времени сталкивается лицом к лицу с вирусом IBD, который распространился по всему миру, включая большинство африканских стран. Начиная с конца 80-х острые и тяжелые вспышки IBD, с 30%-ой смертностью в бройлерных хозяйствах, были зарегистрированы в нескольких европейских странах. Высокая смертность указывала на увеличение патогенности штаммов IBD, которые были классифицированы как высоковирулентные IBDV (vvIBDv). Болезнь легко диагностируется, если во время полевой вспышки присутствуют смертность и клинические признаки. Однако существует много случаев, когда постановка диагноза является гораздо более трудной задачей: субклиническое течение IBD, позднее проявление IBD, взаимодействие нескольких иммунодепрессивных факторов.

Доступные диагностические методы IBD

Традиционно диагноз болезни Гамборо устанавливали, используя несколько методов, разработанных для обнаружения вируса или антител, выявляемых непосредственно вирусом. Когда идет речь об обнаружении антител, выявляемых вирусом, используются три основных диагностических метода: Elisa, тест диффузионной преципитации в агаровом геле и вирусная нейтрализация. В настоящее время Elisa широко используется и обычно применяется, для оценки иммунного ответа на вакцины, и с целью обнаружения возможного контакта с полевыми вирусами IBD. Два других метода (РДП и РН) обычно не используются, так как они являются недостаточно чувствительными или достаточно трудоемкими. Обнаружение вируса выполняется методом изоляции вируса, окраски и молекулярной диагностики. Изоляция вируса проводится на СПФ эмбрионах. Данный метод является очень чувствительным, но дорогостоящим и трудоемким. Методика окрашивания (иммунопероксидаза и иммунофлюоресценция) обладает низкой чувствительностью, так как для ее применения требуется высокая концентрация вируса, и она должна быть использована в острой фазе инфекции. И, наконец, последние методы – методы молекулярной диагностики, которые позволяют обнаружить генетический материал вируса.

Молекулярные методы обладают целым рядом преимуществ

В настоящее время, мы обладаем различными молекулярными диагностическими инструментами, для определения присутствие вируса IBD и впоследствии идентификации определенных видов штаммов (типирование). Данные молекулярные методы очень чувствительны и обеспечивают получение достоверной информации, и в последнее время, становятся все более и более популярными. Большинство молекулярных методик направлено на определение порядка вариабельной области гена VP2, который состоит из 345 нуклеотидов. Данный участок, как известно, кодирует антигенные детерминанты вируса, индуцирующие выработку нейтрализующих антител, которые обеспечивают иммунитет против болезни Гамборо. Кроме того, мутации нуклеотидов и аминокислот могут происходить в переменной области VP2. Это важно для изучения вариабельной области VP2 с целью дифференциации антигенных свойств у разных штаммов вируса IBD. Также возможно определение патотипов, поскольку известно, что некоторые аминокислоты, находящиеся в разных положениях в вариабельной области, являются индикаторами патогенности вирусов болезни Гамборо ( Аланин 222, Изолейцин 256, Изолейцин 294). Они являются маркерами патогенности вируса.

RT/PCR-REA обнаруживает и идентифицирует вирусы IBD

Обнаружение вируса Гамборо выполняется при помощи метода RT/PCR (метод ПЦР – рестрикции с применением обратной транскрипции и определением длинны полиморфного фрагмента цепочки). Используя данную методику, можно обнаружить все штаммы IBD, независимо от их уровня патогенности и антигенной структуры. Методом фенотипирования является – REA (Рестрикционнный Энзимный Анализ). Продукты PCR обрабатывают различными рестриктазами (нуклеазами – ферментами, расщепляющими нуклеиновые кислоты), которые позволяют дифференцировать vvIBD (высоковирулентные штаммы IBD) от классических патогенных вирусов IBD. Рестриктазы могут рассматриваться в качестве ножниц для генетического материала, которые разрезают ДНК в определенном порядке.

Рис. 1. Молекулярные методы, такие как RT/PCR в реальном времени с последующей рестрикцией, являются очень эффективными для обнаружения и дифференциации вирусов IBD:

Дифференциация vvIBDV (высоковирулентного вируса IBD) от cvIBDV (классический патогенный вирус IBD). BspMI рестриктаза «разрезает» высоковирулентный штамм IBD (полоска 3) и не оказывает действия на классический патогенный штамм IBD (полоска 7). SacI рестриктаза не «разрезает» vvIBD (полоска 2), но делает это в полоске 6 (cvIBD). Таким образом, можно идентифицировать оба вируса IBD.

Сиквенс дает наиболее исчерпывающую информацию

Сиквенс определяет последовательность всех нуклеотидов в гипервариабельной области. После сиквенирования, можно получить подробную информацию о мутации и ее последствиях для аминокислот. Кроме того можно определить участки расщепления любой рестриктазы. Оценка влияния мутаций на биологическую функцию или антигенные свойства вируса IBD до сих пор являются предметами для дискуссий. После выполнения сиквенирования также можно провести филогенетические исследования, чтобы определить уровень родства среди различных вирусов IBD. И, кроме того, установить гомологию VP2 между различными вирусами IBD.

График 1
Гомология Hipragumboro-GM97 со штаммами vvIBDV, полученными из разных европейских стран

Практическое применение молекулярных методов

Рекомендуется регулярно проводить мониторинг вируса IBD в птицеводческих хозяйствах для оценки штаммов, циркулирующих на бройлерных птицефабриках для того, чтобы иметь возможность правильно составить схему вакцинации.

Рис. 3. Техника отпечатка на карте FTA®

Рис.4 Карта FTA® после взятия образцов

В настоящее время карты FTA® дают прекрасную возможность для отправки образцов патологического материала в лаборатории, так как они сохраняют генетический материал вируса. У карт FTA® есть 4 зоны, для фиксации отпечатков образцов (круглые области на внешнем крае каждой карты). Рекомендуется использовать одну или две карты (по четыре области накарте) для одного птичника. В центре круга делают отпечаток образца бурсы. После чего дают отпечаткам высохнуть на воздухе в течение от 40 минут – 1 часа. Как только карта полностью высохнет, она упаковывается в индивидуальный полиэтиленовый пакет и отправляется в лабораторию.

В лаборатории образцы с карт FTA® исследуют следующими методами:
– RT-PCR (ПЦР с применением обратной транскрипции). Этот метод позволяет обнаружить вирус и дает возможность определить время инфицирования, или качество проведенной вакцинации.
– REA (Рестрикционный анализ): идентификация вируса. Этот метод помогает отличить полевой вирус от вируса вакцины.
– Сиквенирование: позволяет изучить особенности циркулирующего вируса и сравнить его с различными IBD вирусами.

Програмы технической подержки: Lymfos VAC и Lymfos BROILERS

Технические программы дают основные рекомендации по стратегии борьбы с болезнью Гамборо. Эти программы направлены на изучение и контроль болезни Гамборо. В настоящее время компания Hipra предлагает две разные программы, Lymfos VAC и Lymfos BROILERS, которые уже успешно применяются целым рядом компаний во всем мире. Эти программы предусматривают серию последовательных исследований, основанных на еженедельном отборе образцов Фабрициевых сумок.

Образцы исследуют молекулярными методами диагностики, такими как RT-PCR (Обратно транскриптазная-полимеразная цепная реакция) в сочетании с рестрикционным энзимным анализом (РЭА). Проводится секвенирование VP2 и филогенетические исследования с целью определения гомологии IBD вирусов, циркулирующих в хозяйстве с другими референтными вирусами.

Lymfos VAC

Конечной целью вакцинации является обеспечение рентабельного производства птицы. К сожалению, эффективность вакцин зависит от ряда других факторов, которые не связаны непосредственно с вакцинами. Чтобы убедиться в успешности вакцинации, необходимо получить подтверждение факта проникновения вируса вакцины в бурсу и его дальнейшей репликации в ней при помощи молекулярных методов.

Программа Lymfos VAC начинается в момент вакцинации, который является первой отправной точкой для взятия проб патологического материала. Как только подтверждено, что цыплята не инфицированы vvIBDv или другим циркулирующим в хозяйстве вирусом IBD, необходимо убедиться, что бурсы не инфицированы и готовы к заселению вирусом вакцины. С другой стороны, если бурсы уже инфицированы, можно сделать вывод о том, что возможности вакцины по защите против болезни Гамборо будут значительно ограничены. Следующее еженедельное взятие проб будет через 7 дней после прививки, и это исследование позволит сделать вывод о том, был ли вирус вакцины способен колонизировать бурсу в достаточной степени. Если результат будет неудовлетворительным, и вакцина не колонизировала бурсу, в хозяйстве все еще будет достаточно времени для повторной вакцинации птицы и для создания удовлетворительного уровня защиты.

Lymfos BROILERS

С программой Lymfos BROILERS, еженедельное осуществление отбора проб начинается во время прививки и может продолжаться до конца периода откорма. Для того чтобы определить динамику развития инфекции и определить точное время, когда бройлеры становятся инфицированными. Эта информация будет основой для применения правильной стратегии защиты следующих туров бройлеров. Кроме того, проводят исследование степени специфического поражения бурсы и определение патогенности полевого вируса. Опыт работы доказывает важность определения специфичности вирусов болезни Гамборо, циркулирующих на бройлерной ферме период откорма. Кроме того, крайне важно определить момент, когда птица может быть инфицирована, а также определить источники или резервуары полевого вируса. Таким образом, технические программы Lymfos VAC и Lymfos BROILERS позволят обнаружить «скрытые угрозы», и, тем самым, обеспечить успех в борьбе с болезнью Гамборо.

Источники:

http://www.tsenovik.ru/articles/veterinariya/vaktsinatsiya-i-vaktsiny-protiv-bolezni-gamboro-vaccination-and-gumboro-disease-vaccines/
http://new.uralbiovet.ru/infekcionnyj-bursit-ptic-bolezn-gamboro/
http://hitonug.ru/molekulyarnye-metody-kontrolya-bolezni-gamboro-ibd/